科学家将单分子DNA测序推向新水平

近年来，科学家能够以单分子分辨率研究人体DNA 的技术极大地扩展了我们对人类基因组、微生物组和疾病遗传基础的了解。通过如此详细的 DNA 视图，我们可以看到早期测序技术根本无法检测到的遗传变异和结构细节。

然而，当今单分子分析的黄金标准方法通常需要至少 15 万个人类细胞，其中包含数百万个单个 DNA 分子。这意味着研究人员在只有几千个细胞可用时(例如在许多肿瘤活检中)无法应用这些工具，从而限制了这些技术的科学和临床潜力。

现在，格拉德斯通研究所的研究人员开发了两种新的单分子分析工具，可将所需的 DNA 量减少 90% 至 95%。他们的研究成果发表在《自然遗传学》杂志上，展示了这些工具如何帮助科学家解决他们以前无法回答的生物学问题。

“我们长期以来一直在努力创造这些方法，” 格拉德斯通的助理研究员兼这项研究的资深作者Vijay Ramani 博士说 。“我们非常兴奋地看到现在可能有什么发现。”

标记 DNA，获得更清晰的视野

第一种新工具被称为“单分子实时标记测序”，简称 SMRT-Tag，它扩展了既定的协议，可以同时绘制长 DNA 片段中的碱基序列以及 DNA 长度上称为甲基的化学结构的位置。甲基在基因表达中起着关键作用，因此对于了解疾病至关重要，因此了解它们在 DNA 上的排列方式非常重要。

“当我们只有很少的 DNA 可用时，我们不能直接复制更多的 DNA 并应用我们通常的方案，”拉玛尼说。“复制会剥离这些甲基化模式并引入其他错误。”

相反，他的团队采用了一种名为“标记”的方法，该方法利用细菌蛋白 Tn5 同时将 DNA 分子切割成更易于处理的片段，并用进一步分析所需的化学成分对其进行标记。

当仅有少量 DNA 可用时，标记技术已经用于对短 DNA 片段进行测序 - 但从短片段中只能收集到有限的信息。

Ramani 团队面临的挑战是让标记的生物化学原理恰到好处地将少量 DNA 分解成约 3,000 至 5,000 个碱基对的长片段。他们的方法是用发夹状结构“标记”每个片段的末端，形成可以通过测序仪可靠读取的长 DNA 环。

“这是我实验室的工作人员和学生的一次英勇努力，”拉玛尼说。“我们必须测试不同版本的 Tn5 和近 100 种不同的条件，包括不同的缓冲液、酶和温度。当你处理的 DNA 量如此之少时，任何导致 DNA 损失的问题都会成为更大的问题。”

来自小样本的可操作数据

一旦他们对 SMRT-Tag 进行了优化，研究小组就能证明，它的性能与既定协议一样好，但使用的 DNA 量要少得多——大约相当于在少至 10,000 个细胞中发现的 DNA 量。

拉玛尼说：“使用黄金标准的单分子测序仪器，从来没有人对如此少量的 DNA 进行测序，达到我们现在所达到的覆盖率。”

接下来，他的团队将 SMRT-Tag 与他们之前开发的一种名为 SAMOSA 的方法结合起来，SAMOSA 是“单分子腺嘌呤甲基化寡核小体测序测定”的缩写。

SAMOSA 揭示了反映染色质可及性的额外甲基化模式——或者说，基因表达机制如何轻松访问不同 DNA 片段。

现在，有了新的 SAMOSA-Tag 工具，研究人员能够用比以前少得多的 DNA 来评估染色质的可及性。为了证明这一点，他们将其应用于前列腺癌细胞(一些来自患者的初始肿瘤，一些来自已扩散到身体不同位置的肿瘤)，这些细胞已被移植并在小鼠体内生长。该方法揭示了染色质可及性的差异，这暗示了癌症转移的可能关键驱动因素。

“这只是我们的工具如何应用于癌症和其他 DNA 短缺疾病的临床相关样本的一个例子，”与拉玛尼共同领导这项研究的医学博士 Siva Kasinathan 表示。“我们认为，这其中有一些唾手可得的成果，可以解锁一些新的生物学知识，这对帮助患者来说可能很重要。”

卡西纳坦是斯坦福大学露西尔帕卡德儿童医院的临床研究员，也是格拉德斯通的客座科学家，也是拉玛尼的长期合作伙伴。

Ramani 的团队目前正在优化 SMRT-Tag 和 SAMOSA-Tag，使其能够处理更少量的 DNA。他们还继续在线分享和定期更新他们的协议，邀请其他研究人员提供反馈和合作。“社区和参与其中的人对这项工作的发展至关重要，”Ramani 说。

他特别强调了自己与卡西纳坦的合作，两人在华盛顿大学读研究生时相识。他们一起构思了这项研究。“与我最亲密的朋友之一合作发表我们认为将对人类健康产生巨大影响的研究成果非常有意义。”

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